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干货 | 一文了解基因检测错配酶

人阅读 发布时间:2020-09-14 17:14

Cruiser®酶是一种具天然强活性的核酸内切酶,与 CelⅠ同源。该酶能够高效特异地识别异源双链DNA的突变位点,并从突变位点的3’-端高效地切割异源双链DNA。

本产品能简便高效的检测基因敲除效率和基因多态性,广泛应用于精确检测人、哺乳动物、细菌、真菌、病毒以及植物基因敲除情况,尤其适用于ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9实验中混合样本的突变效率的检测以及阳性克隆的筛选。

Cruiser®酶作用原理
【图1】Cruiser®酶同源酶作用原理图

案例介绍
A.混合样本分析(Pool):
  • 根据酶切后条带的亮度大致估测敲除效率;
  • 因不同宿主物种中敲除载体的转染效率的差异,Pool验证阳性的可能性也会有较大差异,甚至存在Pool验证显示阴性,但最终却筛选到阳性克隆的情况;
  • 一般地,被转染的细胞比例越高,Pool检测越容易进行。

【图2】阳性对照和Pool Cruiser®酶检测结果
M:100 bp-DNA Marker
Positive:Positive Control DNA
Pool:混合克隆

B.单克隆结果分析

【图3】单克隆Cruiser®酶检测结果
M:100 bp-DNA Marker
Positive:Positive Control DNA
Clone1-7:单克隆
如图所示:clone3、5和6为潜在的阳性克隆,后续直接进行TA克隆测序验证等位基因突变情况。

Cruiser®酶检测VS测序
测序筛选
  • 耗时:同城最快次日,一般3日才能得到结果;非同城快递运输耽搁时间。
  • 测序不稳定:测序无信号等;
  • 耗费人力物力财力:需配置核酸胶跑电泳胶回收纯化后再测序,且在送测序等测序结果的时间里细胞却未停止生长,需要耗费大量的人力物力财力去培养大量的单克隆细胞;
  • 尤其不适用于高通量筛选阳性克隆。

Cruiser有测序无法比拟的优点:
  • 无需做胶回收,PCR产物直接酶切,特异性高,精准定位突变位点,无假阳性,对于高通量筛选来说,可以大大节约时间和人力成本;
  • 30min出结果,相对于测序来说时间短,可大大减少细胞传代的次数,节省人力和试剂成本;
  • 单次反应相对于测序更便宜;
  • 提高筛选到敲除阳性克隆的概率:使用Cruiser酶进行pool阳性率验证,当天即可出结果并可稀释处理细胞;若使用测序方法,等待测序结果的时间里pool细胞内阳性克隆比例随传代次数逐渐指数减少,大大加大了筛选难度。
Cruiser®酶(无假阳性) VS T7EI(假阳性高)
下图为3T3细胞FADD基因敲除Cruiser®酶和T7EI检测结果,已知在3T3细胞中FADD基因的敲除效率很低(其敲除pool测序无双峰)。挑12个单克隆经Cruiser®酶切结果显示如图4,而经 T7E1 酶切结果显示如图5。


 
【图4】3T3细胞FADD基因敲除Cruiser® 酶检测电泳图(PCR产物直接酶切)
P1—Cruiser™ 酶切阳性对照(胶回收片段,此阳性对照用T7E1切不开)
P2—T7E1酶切阳性对照( PCR产物未回收)



【图5】3T3细胞FADD基因敲除T7EI检测(PCR产物直接酶切)

结论:对于未做胶回收的PCR产物直接酶切T7EI酶检测全阳性,但随机挑选几个克隆去测序结果证实无突变,说明对于PCR产物直接酶切T7EI假阳性率竟高达100%,而吉锐生物CruiserTM的酶切结果与测序结果一致,都为阴性。

文献引用
Cruiser®酶的应用已经文献报道
报道文献一:

报道文献二:

报道文献三:


产品优势
  • 检测速度快:仅需 5~20min 便可检测到阳性克隆
  • 特异性更高:精准切割突变位点,高效筛选阳性克隆
  • 检测更直观:常规凝胶电泳即可鉴定阳性克隆
  • 检测范围广:可检测 100bp~10kb 的突变 DNA 片段
  • 高通量筛选:更加轻松地从大量样本中筛选阳性克隆
  • 节省人力物力:无需切胶纯化

产品列表


产品应用
  • 突变效率检测—CRISPR/Cas9、TALEN、ZFN及TILLING;
  • 各类细胞、组织、线粒体和叶绿体等基因的突变检测;
  • 碱基替换、插入、缺失和单核苷酸多态性(SNP)检测;
  • 低拷贝基因突变和汇集的DNA样本检测;
  • DNA点突变筛选检测;

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